1. 样品制备① 裂解：◆ 细胞：弃培养上清，无菌 PBS 清洗 1-2 遍（去除细胞和培养皿表面残留的培养基，因为培养基中血清含有丰富蛋白质），加入细胞裂解液（80-100ul/60mm dish） 和蛋白酶抑制剂，置摇床上摇动裂解，注意随时观察。最好冰上裂解（摇床上放冰盒，培养皿放在冰盒中）。◆ 组织：将组织块切割成合适大小，无菌 PBS 漂洗 1-2 遍，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，高速匀浆机匀浆（低温匀浆：装有组织块的 2ml 平底 EP 管外面套一个装满碎冰的小烧杯）或高通量组织破碎仪破碎（提前预冷裂解液，把破碎过程分成几段，缩短每一小段的破碎时间，破碎的间隙把装有组织的 EP 管埋在碎冰里降温几分钟，再接着下一小段的破碎过程）。最好低温裂解。② 去除碎片（充分裂解细胞或组织后，会有一些细胞碎片没办法完全溶解在裂解液中，需要去除）：4℃下 12000rpm 离心 10-20min，取上清。（离心后细胞碎片沉在管底，上清中是抽提出的蛋白）③ 蛋白定量：BCA 法测定蛋白浓度后分装。④ 蛋白变性：加 loading buffer，沸水浴煮 5min。（沸水浴容易把 EP 管盖冲开，为了防止污染，也可以用金属浴或 PCR 仪来使蛋白变性。）⑤ 保存：分装变性后的蛋白质样品-20℃保存，长期保存-80℃。也可以一裂解完就冻存在-80℃，样品凑齐后再拿出来一起做去碎片、定量、变性等后续步骤。2. SDS-PAGE 胶制作及电泳分离2.1 灌胶① 洗玻璃板：玻璃板有不同规格的，能制备不同厚度的 PAGE 胶，要注意选择合适的制胶玻璃板，在制胶前，要使用洗涤剂充分洗净玻璃板和制胶梳子，去离子水冲洗数遍，把玻璃片斜靠在网篮里自然晾干，注意不要有水渍。② 装配制胶架：玻璃板应该是配对的（一片是带玻璃直角的厚板，一片是平滑的薄板），把配对的玻璃板对好，保持两片玻璃板的底边在同一水平面，用制胶支架固定住，再安装到固定架上。注意制胶支架松紧度（紧）、制胶固定架上的夹子上的弹簧的弹性（紧）以及固定架上胶条是否干净，是否具有很好的回弹力，灌胶时要时刻注意是否漏胶，如果稍有些漏，可以在固定架上卡一个 1ml 枪头，如上图，可以人为把固定架上的夹子弄紧一点。如果漏得厉害，就没辙了，只能重新把这一套组装起来。所以最好是同时配几块，总有一块是能用的。③ 配胶液：在 western 中用的 PAGE 胶是不连续的，分两层，上层是积层胶，下层是分离胶。配的时候先配下层的分离胶，使用 500ul 无水乙醇将胶压齐（比水压的效果好），待分离胶凝固后，倒掉无水乙醇，待乙醇挥发后，灌进去离子水清洗一下残余的乙醇，再配上层的积层胶。积层胶需要有一定高度的，一般上样孔底到分离胶之间的距离要有 1-2cm，距离太短了压得不好，太长了分离胶就短了，影响蛋白分离。④ 插梳子：梳子有不同规格，适用于不同厚度的胶和上样体积，需要注意。积层胶液灌进去后要立即插梳子，动作要快，否则上样孔容易变形。插梳子时最好拿张厚草纸挡一挡，因为没有凝固的丙烯酰胺是有毒的，插梳子时不挡着很容易喷一脸，要注意防护。完全聚合成凝胶的聚丙烯酰胺就要安全多了。所以在丢弃剩余的胶液时，可以在等它完全凝固后再丢弃。有时候梳子拔掉了发现上样孔之间的间隔东倒西歪的，那准是插梳子时动作慢了。⑤ 拔梳子：积层胶凝固后不要急着拔梳子，而是应该把玻璃板-胶-梳子这一套作为一个整体拆下来，装进电泳槽，倒好电泳液后再拔，电泳液里含 SDS，拔梳子时会更顺滑。SDS-PAGE 胶配方：△ 表中最后的 X% 是通用的计算公式，随 30%丙烯酰胺的量调整 ddH2O 的量。△ 10% AP 和 TEMED 是催化剂，催化丙烯酰胺聚合，TEMED 可以在 4℃保存较久；10% AP 在 4℃保存不能超过一周（建议买 10g 装的小瓶 AP 粉末，P 粉末室温会吸湿，逐渐失效，因此买回后直接配制好后分装 500ul 一管，冻存在-20℃，用时取出一管溶解，一周之内用完。）2.2 电泳分离原理：样品在 5% 积层胶里会被压缩成一条细线，这是缓冲液中甘氨酸盐离子 Gly-和 Cl- 的作用。在积层胶里，Cl-跑在最前面，中间是蛋白样品，最后是 Gly-盐离子，Gly-和 Cl-之间形成一个电压梯度，压缩蛋白样品；到分离胶时，Gly-、Cl-跑在蛋白前面，蛋白样品脱离了电压梯度限制，开始按蛋白大小以不同速度泳动，从而按蛋白大小分离开来。积层胶浓度：5%左右，pH 6.8。分离胶浓度：7.5-15%，pH 8.8。不同浓度的分离胶对蛋白样品的分离能力是不同的。浓度越低，分离度越好，但小蛋白容易跑出去；常用 10-12%。电泳注意事项：① SDS-PAGE 对离子敏感，使用去离子水配电泳液，电泳槽和配电泳液的容器也需要用去离子水润洗。② 在上样之前，先用胰岛素针把上样孔冲一下。③ 提前一天配好电泳液，混匀放 4℃，到用时，电泳槽稍倾斜，电泳液沿槽内壁缓缓倒入，等液体没过 PAGE 胶底边时，再把电泳槽放平，这样可以保证 PAGE 胶底边没有气泡。（电泳液中含 SDS，如果现配现用，SDS 产生的泡沫会影响电泳，如堆积在 PAGE 胶底边，导致各个泳道出现差异。）④ 往孔里加蛋白样品慢一点，且各孔的上样体积最好保持一致，没有蛋白的那个孔也用 loading buffer 给加到同样的体积，这样跑出来的蛋白条带才能比较均一，否则会出现蛋白条带往体积小或者空的孔那边飘。别忘了上一孔预染蛋白 marker。3. 转膜分湿转和半干转两种。湿转：全部泡在大量转膜液里。三明治是垂直插在转膜槽里的，从负极到正极依次是：海绵垫、滤纸、胶、PVDF 膜、滤纸、海绵垫。半干转：少量转膜液保持三明治湿润。半干转的仪器是水平的，负极在上，正极在下，没有海绵垫，滤纸直接贴电极板，从正极到负极依次是：正极金属板、滤纸、PVDF 膜、胶、滤纸、负极金属板、塑料盖。湿转和半干转的三明治制作及转膜液配方：转膜注意点：① 建议用 PVDF 膜（结合蛋白效率高），因为 NC 膜结合蛋白的效率大概是 80-100ug/cm2，而 PVDF 膜能达到 155-300 ug/cm2。② 转膜时，准备 2 个盘子，大盘子倒上转膜液，小盘子倒上适量的甲醇。把胶从玻璃板上剥下来，切掉积层胶的部分后就浸泡在转膜液里，与胶相同大小的滤纸也浸泡在转膜液里，浸透。切好的 PVDF 膜先别急着泡到甲醇中，而是应该让它轻轻漂在甲醇液面上 10s，在这 10s 中，甲醇就足够将 PVDF 膜激活了，而且要注意在 PVDF 膜激活后不能干掉，所以我们可以先着手做三明治，等要加上 PVDF 膜时再将膜丢进甲醇去激活，一激活就立刻给装进三明治。③ 制作三明治时需要使用玻璃滚棒，或者拿根干净光滑的玻璃试管把膜和胶之间的气泡碾掉。④ 湿转条件一般设置在 200mA 恒流，2.5-3h，时间比较长，需要控制发热，因为发热会影响转膜效果。最好准备一个大冰盒装满碎冰，加点水，把转膜槽埋在冰水混合物里降温；还可以在转膜槽里加一颗磁力转子，把冰盒和转膜槽整个放在磁力搅拌器上，一遍搅拌一边转；或者直接把转膜槽塞到 4℃ 冰柜里降温。 伯乐的转膜槽发热厉害，需要控制发热；法玛西亚的转膜槽，热量控制比较好，可以做到一点都不发热。⑤ 半干转的三明治要保持湿润，但是三明治周围的金属板要保持干燥。⑥ 半干转的条件是用恒压 20V，20min-1h。如果蛋白大的可以延长转膜时间。⑦ 湿转能转的蛋白大小范围非常宽，普通的半干转适合转 30-120KD 大小的蛋白，有些特殊设计的半干转与湿转一样，可以转任意大小的蛋白。这需要看具体机器而定。⑧ 转膜液也需要用去离子水配制，转膜槽和容器需要用去离子水润洗，转膜液配方需要根据蛋白大小来调整，大蛋白（>100 kD）：SDS 1g，甲醇 0 ml；小蛋白（<100kD）：SDS 0g，甲醇 200ml。⑨ 在转膜的过程中，SDS 和甲醇的作用刚好相反。SDS 与蛋白质结合后，能使蛋白更容易从胶上转出来，但又能阻止蛋白与膜结合，尤其是蛋白与 NC 膜的结合。因此，大蛋白不容易转出，要额外加 SDS；小蛋白靠 PAGE 胶里的 SDS 就足够转出了。过多的 SDS 还会影响电流，增加发热，从而影响某些蛋白的抗原性。所以需要根据情况控制 SDS 的含量。甲醇能破坏 SDS 与蛋白的结合，促使蛋白与膜结合，但会减小 PAGE 胶的孔径，使一些蛋白发生沉淀，从而影响实验结果，所以也得严格控制量。4. 抗体杂交1> 封闭：使用 5%脱脂牛奶 或 5% BSA（用 TBST 溶解）作为封闭液，封闭条件：室温 1h，或 4℃过夜。（目的蛋白转膜后，但膜上还有很多其他蛋白，因为跑胶用的是总蛋白，其他非目的蛋白也会随着转移到膜上，这样就会暴露出很多抗体结合位点，因此需要在抗体杂交前封闭膜。） BSA：一般是做蛋白磷酸化修饰检测时用，因为牛奶中含有丰富的磷酸 酶，会改变蛋白磷酸化修饰的状态。有时，封闭液配方和封闭条件也需要 改变，特别是大蛋白，5%脱脂牛奶封闭一小时不够；有的蛋白可能牛奶和 BSA 都不能用，可以用明胶封闭或不封闭直接上抗体。2> 一抗孵育：使用封闭液稀释一抗，4℃过夜，或室温或 37℃ 1-X h。3> TBST 洗膜，室温，5min ×4 次。4> 二抗孵育：室温 1h。5> TBST 洗膜，室温，5min ×8-12 次。6> ECL 显色，X 光片压片或扫膜。TBS 配方：1L TBS 中加入 1ml Tween 20 就是 TBST。Tween 20：一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可以提高抗体特异性识别能力；提高封闭效果，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点，可以降低抗体的非特异性结合；乳化蛋白时不会破坏蛋白结构。5. 图像分析使用 Gel-Pro Analyzer 或 ImageJ（推荐）；后面会单独整理这方面内容；6. 常见问题分析1) 非特异条带：抗体浓度过高； 解决方法：降低抗体浓度；封闭不足；解决方法： 提高封闭液浓度，如从 5% 提高到 7%； 增加封闭时间和/或温度； 向封闭缓冲溶液中加入 0.05% 的 Tween 20； 抗体稀释液采用相同的封闭液；SDS 使抗体和蛋白条带发生非特异性结合： 解决方法： 转膜后洗涤印迹膜； 在免疫检测过程中不要使用 SDS；抗体质量：尝试使用不同的抗体；2) 条带弱或无条带：抗体问题，低活性或低浓度、低亲和力的一抗，错配的一抗和二抗： 解决方法： 提高抗体浓度； 抗体可能已经丧失活性，进行斑点杂交以确定其活性和最佳浓度； 测试不同一抗和/或一抗-二抗组合；抗原抗体反应不足：解决方法： 增加凝胶中每个样品的总蛋白上样量； 检查样品的完整性，确保蛋白未降解；抗原被封闭液封闭： 解决方法： 尝试不同的封闭液 （比如，在检测磷酸化蛋白时避免使用牛奶）； 优化封闭液浓度，建议使用浓度为 3–5% 的 BSA 或脱脂奶粉；化学发光底物性能不佳： 增加底物孵育时间； 准备少量工作液以确定底物是否已经丧失活性，暗室内，在底物工作液中加入少量 HPR 偶联物则应该会出现蓝光。如果没有的话，必定是底物或HRP 偶联物已丧失活 性； 确保底物试剂盒中的两个瓶子之间没有发生交叉污染。两种试剂之间如果发生交叉 污染，则会引起试剂活性下降； 叠氮化物是 HRP 的抑制剂，不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物；印迹膜上抗体去除和再杂交： 优化抗体去除条件； 仅在必要时进行再杂交检测； 避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交；转膜不足： 转膜时间过短，如果使用湿转法，则需增加转膜时间； 转膜电场过弱，增加转膜电压或电流； 转膜液未优化，在转膜液中加入 0.01-0.05%的 SDS； 将转膜液中的甲醇浓度减少至 5% 或更少； 凝胶选择不恰当，使用更低百分比的聚丙烯酰胺凝胶； 在转膜后使用丽春红染液染膜，考马斯亮蓝染液染胶，确认转移效率，并在此基础上 优化转膜条件；转过了： 转膜时间过长，减少时间； 转膜电场过强，降低转膜电压或电流； 转膜液未优化，组装“三明治”之前，在转膜液中平衡凝胶 20 分钟以降低凝胶中 SDS 浓度，从而避免小分子量蛋白的过度转移；。 将转膜液中的甲醇浓度增加至 40%； 凝胶选择不恰当，使用更高百分比的丙烯酰胺凝胶； 当目标蛋白分子量小于 10 KD 时使用 Tris/tricine 凝胶。使用 0.2 μm 的膜解决小蛋 白转印过度的情况； 小蛋白会穿过大孔径的印迹膜，在 0.45μm 的膜后叠加 0.2 μm 的膜检测小蛋白转印 过度情况；3) 信号过饱和：中空条带： 上样量过高，降低每个样品的总蛋白上样量 抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度 化学发光底物过灵敏，更换使用灵敏度较低的化学发光底物；条带过浓以至于条带粘连在一起： 样品上样量过大，降低每个样品的总蛋白上样量； 抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度；4) 条带上有气泡：“三明治”组装不恰当： 在组装 “三明治”的时候使用更多的转膜缓冲液； 组装“三明治”的时候碾掉了凝胶和膜之间所有的气泡； 在抗体孵育前用丽春红染液 染膜，以检查转膜质量；5) 转膜不均匀：印迹膜部分变干或水化不均匀： 确保整张印迹膜均匀浸入转移缓冲液中并充分平衡； PVDF 膜在放入缓冲液之前需要用 100% 的甲醇预先浸湿平衡；硬件问题： 检查湿转装置的线路连接； 确保金属平板清洁，无物理损伤，即便是金属平板发生轻微弯曲也可以极大地改变半 干转印系统的电场强度； 使用质量可靠的转膜仪；6) 背景过强：一抗和/或二抗浓度过高：稀释一抗和/或二抗浓度；封闭不足： 提高封闭液浓度，如 3–5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、 脱脂牛奶； 降低封闭时间和/或温度； 向封闭液中加入 0.05% 的 Tween-20； 抗体稀释液采用相同的封闭液（加入 0.05%的 Tween-20)；使用了错误的封闭液，一抗和/或二抗与封闭缓冲液中的蛋白相结合：尝试其他封闭液（白蛋白、酪蛋白、 脱脂牛奶等），在使用亲和素-生物素系统时不要使用牛奶来封闭印迹膜 — 牛奶含有生物素；洗涤不足： 增加洗涤次数和缓冲液用量 （最少 5 × 5 分钟）； 如果洗涤液中未含有 0.1%的 Tween -20，请添加；曝光时间过长： 减少成像曝光时间；印迹过程中印迹膜变干： 确保印迹膜保持湿润； 确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干；缓冲液重复利用导致污染：使用新制缓冲液；7) 背景有污迹：部分印迹膜变干： 确保印迹膜保持湿润； 确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干；洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足： 增加洗涤缓冲液用量； 避免过多印迹堆叠在一个孵育容器内；洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足：使用干净的或新的转移“三明治”；印迹膜污染： 请勿用手直接接触印迹膜。一直配戴清洁手套或使用医用镊子； 确保电泳设备、转移设备和孵育盘清洁，远离外部污染源；8) 背景有斑点：凝胶碎片粘附于印迹膜之上：将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除；成块的封闭剂粘附于印迹膜之上： 确保封闭剂在使用前完全溶解； 向封闭缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20；抗体聚合： 使用 0.2 μm 的过滤器过滤抗体缓冲液 使用新鲜抗体 向抗体缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20缓冲液污染： 使用新的缓冲液； 使用 0.2 μm 的过滤器过滤缓冲液；9) 不同样品间内参蛋白含量不一致：在实验过程中，选为内参的持家蛋白表达水平发生变化 在实验条件下识别并验证选用的内参蛋白的一致性，即证实目前实验条件并不会改 变该内参蛋白的表达水平； 用染料给膜上的总蛋白染色，并以膜上检测到的总蛋白为内参；10) 内参蛋白检测信号饱和：在实验过程中，选为内参的持家蛋白表达水平发生变化： 减少上样量以消除信号饱和； 稀释抗体浓度或减少孵育时间以避免检测信号饱和； 选择另一个一致性表达的低丰度蛋白作为内参； 用染料给膜上的总蛋白染色，并以膜上检测到的总蛋白为内参；————————————————
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