导语
中性粒细胞形成称为中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的细胞外网状结构。新出现的证据表明，癌症可以诱导 NET 的形成；然而，尚未完全了解 NETs 如何影响癌症生物学，并且尚未就其促癌或抗癌作用达成共识。
背景介绍今天小编为大家带来的这篇文章，探索和讨论了 NET 富集、NET 相关基因调控模式，以及 NET 对 22 种主要人类癌症类型的大约 8,000 名患者的预后影响。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为8.786，文章题目为：Pan-Cancer Analysis Reveals a Distinct Neutrophil Extracellular Trap-Associated Regulatory Pattern。
数据介绍本研究从 TCGA 数据门户网站下载了 22 种人类癌症类型的大约 10,000 名患者的 FPKM 标准化 mRNA 表达谱和临床特征。去除批次效应后，从 UCSC Xena 下载包含大约 10,000 个样本的 PanCan TCGA 表达集。BRCA 蛋白表达谱是从 CPTAC下载的。从登录号为 GSE78220 和 GSE91061 的 GEO 数据集下载 2 个膀胱癌样本和 1 个皮肤癌样本的基因表达阵列。技术路线本研究技术路线如图所示。
结果解析01泛癌NET相关失调的定义为了对不同癌症类型的 NET 进行概述，本研究定义了 22 种癌症中 23 个基因的泛癌 NET 特征。为了量化浸润的 NET，本研究计算了每种癌症类型的 NET 签名（NET 分数）的 GSVA 富集分数。不同肿瘤类型的 NET 评分差异很大（图 1A），头颈癌 (HNSC) 和两种类型的肺癌（LUAD、LUSC）成为 NET 富集的前三种癌症类型。
接下来本研究比较了 PANCAN 数据集中肿瘤和副肿瘤组织与个体癌症类型之间 NETs 相关基因的表达水平，并发现了不同癌症类型和基因的失调模式。其中 CAT、CTSG、LTF、LCP1、S100A8 和 S100A9 失调最严重；LUSC、LUAD、GBM、ESCA、CHOL 和 CESC 显示出失调的 NET 基因的最高积累（图 1B）。此外，火山图显示大多数 NET 相关基因在泛癌分析中上调（图 1C）。
图 1
NET 形成是一个复杂的调节过程，涉及一系列生物学步骤和遗传相互作用；因此，本研究决定研究 NET 基因的相互作用模式。为此，本研究在 STING 数据库中检查了 NET 基因的潜在蛋白质-蛋白质相互作用网络 (PPI)，并发现了一个复杂的相互作用网络，表明由 NET 形成的共同调节网络（图 1D）。总之，这些结果揭示了各种癌症类型中 NET 形成的失调模式。
02NET分数与主要癌症标志密切相关，尤其是炎症反应本研究进一步探讨了 NET 评分与几个关键癌症标志之间的关系，包括血管生成、抗细胞凋亡、非整倍体、上皮间充质转化 (EMT)、糖酵解、缺氧、炎症反应和细胞增殖。本研究比较了 NET 和标志分数之间的 Pearson 相关性，这些分数由基因集的 ssGSEA 分数表示。八个标志中有六个与 NET 分数呈正相关。在这一组中，炎症反应显示出最高的相关性，在 22 种癌症类型中，有 14 种的 R 值超过 0.6。相比之下，增殖和非整倍体与 20 种癌症类型的 NET 评分呈负相关（图 2A）。使用 MCPcounters，本研究对 10 种免疫和基质细胞成分进行了反卷积，发现 NET 评分与大多数癌症类型中的单核细胞、中性粒细胞和髓样树突状细胞之间存在正相关；然而，本研究发现 NET 评分与细胞毒性 T 细胞、NK 细胞或 B 细胞之间没有显著关联（图 2A）。本研究还比较了每种癌症类型的 NET-high 和 NET-low 组之间几种类型免疫细胞的趋化因子谱。火山图显示，NET-high 组趋化因子的表达水平普遍较高，并且在所有癌症类型中对粒细胞和白细胞的趋化作用可能更强，表明 NETs 与癌症免疫细胞之间存在复杂的调节网络（图2B )。
图 2
然后，本研究在接受抗 PD1 治疗的 3 个独立队列中比较了反应组（PR、CR）和无反应组（SD、PD）之间的 NET 评分 。与 NET 评分和免疫检查点基因之间的相关性一致，3 个队列中有 2 个的无反应组的 NET 评分显著更高（图 2C）。这些发现强调 NETs 作为关键癌症相关生物过程和肿瘤相关免疫学的中央调节器，并表明 NETs 可能预测免疫检查点抑制结果。03NET对不同癌症类型具有不同的预后影响为了研究 NET 评分对癌症预后的影响，本研究分析了来自 22 种不同癌症类型的 8,059 名患者的数据。这些患者根据 NET 评分分为 4 类，并通过 Kaplan-Meier 分析比较他们的生存率。NET 评分最高分位数的癌症患者预后最好，而最低分位数的患者预后最差（图 3A）。由于所选癌症类型包含非常不同类型的恶性肿瘤，因此本研究随后分别评估了每种癌症类型的 NET 相关生存率。在前列腺癌 (PAAD)、食道癌 (ESCA)、皮肤癌 (SKCM)、肉瘤 (SARC)、乳腺癌 (BRCA) 和结肠癌 (COAD) 中，较高的 NET 评分与有利的生存相关。相比之下，在胰腺癌 (PDAC)、肺鳞癌 (LUSC)、胶质母细胞瘤 (GBM)、低级别胶质瘤 (LGG)、卵巢癌 (OV)、胃癌 (STAD) 和膀胱癌 (BLCA) 中，更高NET 分数与较差的生存率相关（图 3B）。这些结果表明在不同的癌症类型中存在两种 NET 相关的生存模式。
图 3
04确定存活率高或低的癌症中NET相关的调节模式
为了解释不同癌症类型的不同 NET 相关结果，本研究定义了与每种癌症类型的 NET 评分密切相关的 NET 相关基因 (NRG) 组。总共确定了 35,034 个 NET-NRG 对，其中 15,476 个属于 NET 相关生存率较高的癌症，19,558 个属于 NET 相关生存率较差的癌症（图 4A）。在每个生存组中超过 5 种癌症类型中鉴定出的 NET-NRG 对被进一步定义为核心 NET-NRG 对，NET相关生存良好的癌症类型中有533对NET-NRG对，NET生存较差的癌症类型中有709对NET-NRG对，其中411 对重叠（图 4B）。
为了进一步探索 NRG 失调，本研究重新检查了 HepG2 和 MHCC97H 癌细胞的 RNA 数据在-之前的研究中有没有 NET 刺激。该分析表明，在 NET 刺激后，具有良好或不良存活率的 NRG 以及所有 NRG 都被上调（图 4C、D）。
图 4
两组 NET-NRG 对具有不同的生物学功能。两组 NET-NRG 对的 KEGG 注释表明，具有良好 NET 相关生存率的癌症类型中的 NET-NRG 对富集在Rap1、鞘脂信号和松弛素信号通路。对于 NET-NRG 对，在 NET 相关生存率较差的癌症中，富集在局灶性粘连和 ECM-受体相互作用。对于共享的 NET-NRG 对，富集在细胞因子相关通路和金黄色葡萄球菌感染（图 4E-G）。这些模式可能对 NET 相关的生存产生至关重要的影响。
05NET相关的调控模式与预后相关的共表达基因簇有关本研究假设 NET 相关基因包括 2 组：具有促肿瘤作用的基因和具有抗肿瘤作用的基因。为了探索这种可能性，本研究评估了 NRG 在各种癌症类型中的个体表达偏倚，并确定了 NET 评分的总体预后影响。本研究使用单变量 Cox 模型计算了 NRG 的风险比 (HR)，并将 NRG 的平均值作为截止值。本研究绘制了 NRG 的 HR 分布，并将 NRG 分配给泛癌背景下预后不良或良好的预后标志物组。结果发现NET 相关生存率较差的癌症类型中的 NET 相关调控基因往往具有风险决定性，例如 LGG 和 GBM（图 5A、B）。在 298 个与生存率低的癌症类型相关的 NRG 中，559 和 562 个模型符合 HR >1 或 <1 ，而在 122 个具有良好生存率的 NRG 中，其他模型符合 HR <1（图 5C）。本研究验证了NET 刺激前后 HepG2 细胞转录组的 RNAseq 数据中的 NRG 表达变化，并且也证明了这些基因在 NET 刺激后被上调（图 5D）。本研究对 18 个与泛癌预后不良相关的 NRG、22 个与良好泛癌预后相关的 NRG 和 23 个 NET 评分基因应用了 STRING 分析（图 5E）。仅保留具有至少一种相互作用的基因，在 STRING 数据库中鉴定了总共 135 个基因-基因相互作用。NETs 与与预后不良相关的 NRGs 有更密切的关联。
图 5
为了进一步探索这些基因的生物学功能，本研究进行了 KEGG 注释。图中显示了按 p 值排序的前 10 条富集通路（图 5F、G）。对于与泛癌预后不良相关的 NET 相关调控基因，与细胞外基质调节通路最为相关。对于与有利的泛癌预后相关的 NET 相关调节基因，T 细胞免疫调节占主导地位。06SPP1为促进NET相关恶性肿瘤的关键基因
本研究通过仅保留在具有有利/不良 NET 相关生存的癌症类型组中具有正相关性 > 5 的对以及在另一组癌症类型中的正相关性 < 2 来缩小基因-NET 对的数量。在 NET 相关生存率良好或较差的癌症类型中，本研究确定了 20 和 11 个 Pearson R 值 > 0.4 的 NRG（图 6A）。本研究比较了两个癌症组之间的基因表达水平，并定义了一组与 NET 普遍相关的基因，其中 SPP1 在 NET 相关生存率较差的癌症中高表达（图 6B）。 SPP1 和 NET 评分之间的 Pearson R 值表明，SPP1 仅在 NET 相关生存率较差的癌症类型中与 NET 评分呈正相关，在具有良好 NET 相关生存率的癌症类型中，未发现相关性（图 6C）。本研究使用单因素 Cox 模型进一步探讨了基因和 NET 评分对患者结果的综合影响。结果发现不同亚组之间存在显著的生存差异，其中 SPP1/NETs 高患者中预后较差（图 6D）。本研究发现 SPP1 在 NET 相关生存率较差的癌症类型中高表达并与 NET 评分相关。
图 6
07SPP1与NETs潜在的协同促肿瘤作用
基于 NET 评分和 SPP1 表达水平之间密切相关的促肿瘤网络的数据挖掘，本研究进一步研究了它们对癌症行为发挥协同作用的潜力。本研究比较每种癌症类型中NETs/ SPP1 高组和低组的EMT评分。结果显示几乎所有癌症类型在 NETs/SPP1-high 组中都显示出显著更高的 EMT 分数（图 7A）。
在进一步的实验验证中，本研究通过 siRNA 敲低了 MHCC97H 肝癌细胞中的 SPP1 表达（图 7B、C），然后应用NET刺激。在肝癌中，NETs在Transwell试验中促进MHCC97H细胞的侵袭；然而，SPP1 敲低消除了 NET 的入侵促进作用(图7D, E)。在体外系统中，本研究探索了SPP1编码蛋白OPN如何影响中性粒细胞，发现SPP1 (OPN)促进中性粒细胞趋化，OPN直接刺激NET的形成(图7F)。SPP1编码分泌因子骨桥蛋白(OPN)，具有广泛的免疫相关调节功能，尤其是髓系细胞。
图 7
由于本研究的数据挖掘揭示了NET得分与SPP1表达之间的紧密联系，本研究假设SPP1也可能对NET具有调节作用。本研究在具有 Hepa1-6 肝癌细胞和过表达 SPP1 (Hepa1-6spp1) 的 Hepa1-6 肝癌细胞的免疫活性小鼠中使用原位模型。结果发现携带 Hepa1–6spp1 的小鼠在肝脏肿瘤中增加了 NET 形成，如两个 NET 标记 MPO 和 H3cit 表达所揭示的那样（图 7G、H）。这些结果表明 SPP1 (OPN) 和 NETs 在促进癌细胞转移方面可能存在合作。
小编总结通过综合分析，本研究现在为 NETs 在癌症中的失调作用提供了一个新的全面视角。本研究发现，除了 NETs 在促进恶性肿瘤方面的明确作用外，还有与 NET 相关的抗肿瘤反应。这种抗肿瘤发生反应的鉴定可能支持开发利用 NET 抗癌作用的新治疗策略。此外，本研究还提供了关于 NETs 如何与其他癌症标志、癌症预后和几个基因集相关联的新见解。在这些新联系中，NET 诱导的炎症反应以及 NETs 对免疫细胞趋化性和趋化因子调节的影响值得进一步研究。本研究的缺点主要在于分析的标记数量。由于实验限制，大多数研究仅分析两个或三个 NET 相关蛋白作为 NET 标记，例如 MPO 或 DNA 水平。也许这种狭隘的观点不足以提供更全面的的视角。总之，本研究的研究结果表明，NET 在癌症中很常见，但在不同的癌症类型中显示出不同的调节模式。而 SPP1 可能是与 NET 相关的不良结果的关键。
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