结直肠癌（CRC）为常见癌症之一，由于肿瘤的转移和复发，CRC死亡率居高不下。结直肠癌的发生和发展涉及一系列的基因和表观遗传改变，还受肿瘤免疫微环境（TIME）影响。虽然目前结直肠癌的化疗和免疫治疗取得了很大进展，但患者预后并不理想。免疫检查点阻断（ICB）治疗仅对一小部分结直肠癌患者有益，而识别CRC内在事件调节免疫检查点阻断疗效的需求尚未得到满足。因此，为了开发新的抗结直肠癌免疫治疗策略，需阐明结直肠癌内源性事件与宿主免疫反应之间的串扰。
N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰是肿瘤生物学中的一种表型调控机制，为信使RNA（mRNA）中最丰富的修饰，调节mRNA的剪接、降解和翻译。m6A修饰由m6A writers（甲基化转移酶）Mettl3/Mettl14/WTAP和m6A eraser （去甲基化酶）AKBH5/FTO动态调节。m6A reader（结合蛋白），如YTHDF1/2/3、YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3，可以直接与m6A修饰的mRNA结合，导致mRNA剪接、输出、稳定性和翻译的改变。但目前m6A修饰对肿瘤免疫微环境 （TIME）的潜在影响仍不清楚。
近日来自香港中文大学于君团队发现ALKBH同源物5 （ALKBH5）能驱动免疫抑制，是促进结直肠癌 ICB 治疗的分子靶点。该研究于2023年5月发表于杂志《Gastroenterology》，题为“ALKBH5 Drives Immune Suppression via targeting AXIN2 to Promote Colorectal Cancer and is a Target for Boosting Immunotherapy.”
图源：《Gastroenterology》
ALKBH5与结直肠癌患者预后不良相关
为评价ALKBH5的临床意义，作者对205例结直肠癌患者ALKBH5蛋白表达进行检测。Kaplan Meier曲线显示ALKBH5蛋白高表达与总生存率差相关。应用多因素COX回归分析ALKBH5的表达与性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期等其他危险因素对结直肠癌预后的影响。结果表明，ALKBH5蛋白高表达是结直肠癌患者预后不良的独立因素，且ALKBH5的mRNA高表达预示着结直肠癌患者的总体生存率较低。多变量COX回归分析证实ALKBH5是结直肠癌预后不良的独立因素（图1A）。
ALKBH5缺失
诱导小鼠结直肠癌移植瘤模型的免疫抑制
为了研究ALKBH5介导的m6A修饰是否调节结直肠癌免疫微环境，作者构建了2个稳定的ALKBH5基因敲除的小鼠结直肠癌细胞（MC38和CT26）。MTT法证实沉默ALKBH5可抑制MC38和CT26细胞的体外生长（图1B）。暗示ALKBH5在结直肠癌中的表达可能调节抗肿瘤免疫反应。
接下来，研究人员通过多色流式细胞术研究ALKBH5是否改变了小鼠的免疫细胞组成。在MC38同基因小鼠模型中，ALKBH5基因敲除显著降低了肿瘤体积和重量（图1C）。在ALKBH5缺陷的肿瘤中观察到显著减少的骨髓源性抑制细胞（MDSCs）渗透，包括单核细胞MDSCs和粒细胞MDSCs，以及增加的NK和CD8+T细胞群（图1D）。且在CT26同基因模型中，ALKBH5的缺失显著抑制了肿瘤的生长，并增强了抗肿瘤免疫反应（图1E和F）。免疫荧光染色证实ALKBH5缺失的MC38和CT26肿瘤中MDSCs的浸润减少（图1G）。因此，ALKBH5通过调节MDSCs在结直肠癌中的渗透来调节免疫抑制。
图1.ALKBH5预测结直肠癌患者的不良预后，并调节小鼠结直肠癌中免疫细胞的渗透
人结直肠癌细胞ALKBH5基因敲除
促进CD34＋人源化小鼠的抗肿瘤免疫
接下来，为了验证ALKBH5对人结直肠癌的免疫抑制作用，作者构建了CD34＋人源化小鼠模型，以模拟小鼠的人类免疫系统。免疫低下的NSG小鼠在全身γ射线照射后，经尾静脉注射人CD34＋造血干细胞，16周后只采用人CD45＋细胞>25%的小鼠（图2A）。将携带/不携带ALKBH5基因敲除的HCT116细胞植入人源化CD34＋小鼠体内。结果发现，ALKBH5基因敲除显著抑制了人源化CD34＋小鼠的肿瘤生长（图2B）。
之后作者分析了同种异体CRC移植在人源化CD34＋小鼠体内的免疫细胞渗透情况。MDSCs、NK细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的门控如图2C所示，结果表明ALKBH5基因敲除的肿瘤显示MDSCs减少，但NK细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的渗透增加（图2D），证实ALKBH5诱导了人类结直肠癌的免疫抑制。通过免疫组化染色也发现ALKBH5的高表达与人原发结直肠癌组织中CD8＋T细胞的低渗透相关（图2E）。以上结果表明ALKBH5有助于人类结直肠癌的免疫抑制微环境。
图2.人类结直肠癌细胞中的ALKBH5抑制抗肿瘤免疫
AXIN2信使RNA为ALKBH5介导的m6A去甲基化的靶点
接下来作者进一步对ALKBH5如何促进结直肠癌生长和抑制抗肿瘤免疫进行研究，以探索其作用的分子基础。由于ALKBH5使m6A修饰的mRNA去甲基化，研究人员通过调控ALKBH5表达后检测CRC细胞中整体m6A的水平。结果显示ALKBH5缺失的HCT116和SW1116细胞中整体m6A水平增加，而ALKBH5的过表达降低了总m6A水平。为了揭示ALKBH5的下游靶点，研究人员在ALKBH5被敲除/未敲除的HCT116细胞中进行了MERIP-seq和RNA-seq（图3A）。在ALKBH5基因敲除后，通过RNA-seq方法鉴定了73个上调基因和51个下调基因，过度表达分析表明，差异表达基因主要集中在Wnt/β-Catenin信号转导中（图3B）。接下来，作者分析了基于MERIP-seq的m6A配置文件。与对照相比，ALKBH5基因敲除增加了可检测到的m6A峰的数量（图3C）。研究人员在HCT116-shNC中检测到11,942个m6A峰，在HCT116-shALKBH5中检测到13,514个m6A峰（图3C）。ALKBH5缺失导致356个基因中m6A水平显著增加（图3D）。为了确定ALKBH5-m6A轴的下游靶点，作者重叠了从MERIP-seq和RNA-seq中确定的候选基因（图3E），并发现了5个潜在的ALKBH5下游靶点（AXIN2、RGMB、NGFR、C1orf116和ARL4C）（图3F）。其中，在HCT116和SW1116细胞中，AXIN2在ALKBH5被敲除后持续被诱导表达（图3G）。因此，AXIN2可能是ALKBH5在结直肠癌细胞中的直接靶点。此外，m6A免疫沉淀和RT-PCR表明，ALKBH5的缺失增加了人结肠癌细胞系（HCT116和SW1116）和小鼠结直肠癌细胞系（MC38和CT26）中AXIN2 mRNA的m6A水平；相反，ALKBH5过表达降低了HCT116和MC38细胞AXIN2 mRNA上的m6A水平（图3H）。接下来作者猜想ALKBH5是否能直接与AXIN2 mRNA结合。为此，在HCT116和MC38细胞中进行了抗ALKBH5抗体的RNA免疫沉淀，揭示了ALKBH5和AXIN2 mRNA之间的直接相互作用（图3I）。综上表明ALKBH5与AXIN2 mRNA结合，使m6A标记去甲基化。
图3.AXIN2确定为ALKBH5的候选靶点
ALKBH5破坏IGF2BP1介导的AXIN2 mRNA的稳定性
之后，作者探讨了ALKBH5是否以及如何影响结直肠癌中AXIN2的表达。研究人员发现，在ALKBH5缺失的CRC细胞中，AXIN2的mRNA和蛋白表达均显著增加（图4A），而其表达被ALKBH5过表达抑制（图4B）。鉴于m6A修饰对mRNA衰变有显著影响，作者假设ALKBH5可以调节AXIN2 mRNA的稳定性。结果显示ALKBH5缺失确实稳定了AXIN2 mRNA，而ALKBH5过表达则产生相反的效果（图4C）。为了揭示介导ALKBH5诱导的mRNA降解的m6A readers，研究人员在HCT116细胞中敲除了m6A readers（YTHDF1/2/3、YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3）的表达，发现只有IGF2BP1敲低显著抑制了AXIN2 mRNA和蛋白的表达；此外，抗IGF2BP1抗体的RNA免疫沉淀实验证实了HCT116和MC38细胞中IGF2BP1和AXIN2 mRNA之间的直接相互作用（图4D）。最后，在CRC队列I中ALKBH5和AXIN2在蛋白水平上的表达以及队列II的mRNA水平都呈负相关（图4E）。综上所述，这些数据表明ALKBH5使AXIN2 mRNA的m6A去甲基化，从而降低IGF2BP1介导的AXIN2 mRNA稳定性。
ALKBH5在结直肠癌中
诱导m6A-AXIN2-β-Catenin轴的表达
AXIN2作为β-Catenin破坏复合体中的支架蛋白，促进β-Catenin的降解。由于在RNA-seq分析中，Wnt/β-Catenin被确定为ALKBH5缺失调节的最高信号通路（图3B），作者假设ALKBH5可能通过抑制AXIN2而激活结直肠癌中的Wnt信号。HCT116和SW1116细胞中的ALKBH5基因敲除减少了核β-Catenin的表达；Wnt/β-Catenin信号的两个转录靶点MYC和Cyclin D1的表达在ALKBH5被敲除后显著降低；反之，ALKBH5过表达诱导MYC和细胞周期蛋白D1的表达（图4F）。ALKBH5基因敲除也抑制了MC38和CT26细胞中活性β-Catenin、MYC和细胞周期蛋白D1的表达，而在MC38细胞中过表达ALKBH5则起到相反的作用（图4G）。
为了验证AXIN2是ALKBH5和Wnt/β-Catenin信号之间的分子链接，研究人员在ALKBH5过表达的HCT116和MC38细胞中外源导入了AXIN2。AXIN2的重新表达消除了ALKBH5促进β-Catenin表达和CRC细胞生长的作用（图4H）。且只有野生型（WT）ALKBH5而非突变的ALKBH5，可以抑制AXIN2的表达，并在内源性ALKBH5缺失的情况下恢复HCT116和SW1116细胞中活性的β-Catenin，这意味着ALKBH5以m6A依赖的方式诱导Wnt/β-Catenin信号转导；同样WT ALKBH5而非突变的ALKBH5挽救了ALKBH5基因敲除引起的增殖缺陷（图4I）。综上结果证明ALKBH5通过m6A-AXIN2-β-Catenin轴促进CRC。
图4.ALKBH5通过直接调节AXIN2 mRNA的m6A水平，促进结直肠癌Wnt/β-Catenin信号转导
ALKBH5在结直肠癌中诱导Wnt靶基因DKK1
WNT信号是肿瘤免疫反应的主要调节因子。RNA-seq显示，Wnt/β-Catenin信号的下游转录基因Dickkopf相关蛋白1（DKK1）是ALKBH5基因敲除的最高抑制基因（图5A）。ALKBH5缺失时，在人（HCT116和SW1116）和小鼠CRC细胞系（MC38和CT26）中观察到DKK1在mRNA和蛋白水平的表达减少，而ALKBH5的过表达则起到相反的作用（图5B）。由于AXIN2可以抑制Wnt/β-Catenin信号的激活，因此作者研究了AXIN2是否可以调节DKK1的表达。研究发现AXIN2的重新表达抑制了ALKBH5对DKK1的诱导，这意味着ALKBH5通过AXIN2促进了DKK1的表达（图5C）。与此一致，在队列I和队列II的大肠癌中，ALKBH5和DKK1的表达呈显著正相关（图5D）。DKK1是一种分泌性蛋白，研究人员进一步检测了CRC条件培养液中DKK1的水平。发现去除ALKBH5显著降低了人（HCT116和SW1116）和小鼠CRC细胞系（MC38和CT26）条件培养液中DKK1的水平（图5E），以及携带MC38肿瘤的小鼠血清中的DKK1水平（图5F）。相反，过表达ALKBH5则产生相反的效果（图5E和F）。综上，ALKBH5通过m6A-AXIN2-β-Catenin轴共同促进DKK1在结直肠癌中的表达。
图5.ALKBH5通过诱导结直肠癌细胞外分泌DKK1
诱导MDSCs积聚
ALKBH5通过DKK1促进骨髓源性抑制细胞募集
DKK1已被报道与MDSCs聚集有关。作者推测ALKBH5可能诱导DKK1分泌在结直肠癌中招募MDSCs。为此，从同基因小鼠结直肠癌模型中分离出脾MDSCs，将纯化MDSCs与ALKBH5缺失/未缺失的小鼠CRC细胞共培养（图5G）。发现与对照组相比，来自ALKBH5基因敲除的MC38或CT26的条件培养液吸引MDSCs迁移的能力降低，而这种差异可通过补充重组DKK1蛋白（RDKK1）来消除，且重组DKK1以剂量依赖的方式促进MDSC迁移（图5H）。因此，ALKBH5可诱导DKK1表达以募集MDSCs。
接下来作者猜测ALKBH5是否影响MDSCs的功能。为此，研究人员检测了添加/不添加rDKK1培养的离体脾MDSCs和从添加/不添加ALKBH5的MC38同种异体移植物中分离的肿瘤浸润性MDSCs的功能标志（图5G）。结果发现，在肿瘤浸润性MDSCs中，ALKBH5基因敲除后，MDSCs的两个功能标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和Arg1的表达显著降低。此外，在培养上清液中添加rDKK1可增加MDSCs中iNOS和Arg1的表达（图5I）。为了验证DKK1在介导ALKBH5诱导的免疫抑制中的功能重要性，在体内用抗DKK1抗体中和DKK1。肿瘤长到50~100 mm3后，隔天腹腔注射DKK1中和抗体，发现抗DKK1治疗取消了ALKBH5对肿瘤生长和MDSC浸润的促进作用，伴随着肿瘤中NK细胞和CD8+ T细胞的恢复（图5J-K）。因此，ALKBH5诱导DKK1表达，将免疫抑制的MDSCs募集到结直肠癌肿瘤微环境中。
肠道特异性Alkbh5敲入蛋白促进小鼠结直肠肿瘤发生并抑制抗肿瘤免疫
为了证实ALKBH5在自发性结直肠肿瘤发生中的作用，研究人员培育了肠道特异性ALKBH5敲入蛋白（Alkbh5 KI）小鼠，Alkbh5 KI小鼠及其WT幼鼠被给予偶氮氧甲烷加DSS以触发肿瘤形成（图6A）。最终，与WT同窝小鼠相比，Alkbh5 KI小鼠的肿瘤负荷更高且肿瘤更大（图6B）。Ki-67染色结果显示，与WT相比，Alkbh5 KI小鼠肿瘤和肠隐窝中增殖细胞比例增加 （图6C）。TIME方面，与WT小鼠相比，Alkbh5 KI小鼠肿瘤中MDSC浸润增加，伴随着NK和CD8+T细胞的显著减少（图6D）。免疫荧光染色证实在Alkbh5 KI小鼠来源的肿瘤中有明显的MDSCs积聚（图6E）。此外，与WT小鼠相比，Alkbh5 KI小鼠的肿瘤显示AXIN2表达减少，但活性β-Catenin和DKK1蛋白表达增加（图6F）。这些结果表明，Alkbh5通过m6A-AXIN2-WNT-DKK1轴促进免疫抑制的肿瘤微环境进而促进结直肠癌的发生。
图6.Alkbh5促进肠道特异性Alkbh5敲入（KI）小鼠的结肠癌发生并抑制抗肿瘤免疫
靶向ALKBH5或DKK1增强
抗PD1治疗对结直肠癌的抑制作用
鉴于ALKBH5诱导DKK1分泌招募抑制性MDSCs以减弱抗结直肠癌免疫反应，作者研究了靶向ALKBH5或DKK1是否可以提高抗PD1治疗的疗效。为了在体内靶向ALKBH5，研究人员使用团队研发的VNP系统将特定的ALKBH5-siRNA输送到肿瘤中，之后用VNP-siNC或VNP-siALKBH5治疗MC38同基因肿瘤模型，给予/不给予抗PD1治疗，结果发现与VNP-siNC相比，VNP-siALKBH5显著抑制了MC38同种异体移植物的生长，且VNP-siALKBH5联合抗PD1治疗对MC38同种异体移植物的生长抑制作用最强（图7A和B）。VNP-siALKBH5联合抗PD1治疗显著减少了MDSCs在肿瘤内的聚集，而CD8+T细胞和NK细胞的浸润增加（图7C）。此外，联合治疗组的MC38同种异体移植物中颗粒酶B+、肿瘤坏死因子α+和干扰素γ+ CD8+T细胞的表达水平最高（图7D）。因此，靶向ALKBH5可增强免疫检查点阻断治疗结直肠癌的疗效。
接下来，作者探讨了阻断DKK1是否也增强了抗PD1治疗的疗效。采用抗DKK1、抗PD1或组合治疗MC38肿瘤，与对照组相比，抗DKK1或抗PD1治疗均显著抑制肿瘤体积和重量，而组合治疗对肿瘤的抑制作用最强（图7E和F）。与对照组相比，联合应用抗DKK1和抗PD1可显著减少MC38同种异体移植物中的MDSCs，增加CD8+T细胞和NK细胞的浸润（图7G），且组合治疗诱导了最强的抗肿瘤免疫反应（图7H）。因此，抗DKK1抗体可增强结直肠癌对抗PD1抗体的治疗反应。
图7.VNP-siALKBH5/抗DKK1加抗PD-1联合治疗可协同抑制过表达ALKBH5的MC38异体移植物的生长
总
结
总的来说，本研究发现结直肠癌中ALKBH5的表达通过m6A-AXIN2-WNT-DKK1轴招募骨髓源性抑制细胞，抑制抗肿瘤CD8+ T和自然杀伤细胞的渗透。提示靶向ALKBH5或DKK1可重新激活抗肿瘤免疫，并与抗PD1免疫检查点阻断治疗协同抑制结直肠癌生长。此外发现在多个结直肠癌患者队列中，ALKBH5的高表达与预后不良相关，ALKBH5可能是判断结直肠癌患者预后的潜在指标。
全文总结图
Zhai J, Chen H, Wong CC, Peng Y, Gou H, Zhang J, Pan Y, Chen D, Lin Y, Wang S, Kang W, To KF, Chen Z, Nie Y, He HH, Sung JJ, Yu J. ALKBH5 Drives Immune Suppression Via Targeting AXIN2 to Promote Colorectal Cancer and Is a Target for Boosting Immunotherapy. Gastroenterology. 2023 Aug;165(2):445-462.
本文作者
杨亚莲
中国药科大学 药理学硕士
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