内容来源：中华结直肠疾病电子杂志原文链接：专家论坛 | 免疫组化筛查林奇综合征的缺陷和应对策略
引 言：
上海长海医院肛肠外科高显华教授、张卫教授；上海长海医院病理科白辰光教授2019年在中华结直肠疾病电子杂志专家论坛栏目发表《免疫组化筛查林奇综合征的缺陷和应对策略》一文中：对LS筛查、IHC检测dMMR的病理报告、MMR常见染色形式和原因、MMR异常染色情况、MMR蛋白IHC结果解读的常见错误等进行了详细介绍，内容丰富；
摘 要
林奇综合征（LS）是由于错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）的胚系突变引起的，是最常见的遗传性结直肠癌综合征，约占所有结直肠癌的3%。目前，多个权威国际组织建议对所有初诊的结直肠癌患者进行LS的普查。LS的普查方法包括免疫组化（IHC）检测错配修复蛋白缺陷（dMMR）和微卫星不稳定性（MSI）检测两种。IHC由于具有检测费用低、对检测设备的要求低、便于基层医院开展、可以提示突变基因等优点，成为LS筛查的首选。但是，由于组织固定、抗体质量、IHC染色技术问题以及不寻常的染色模式，IHC结果容易出现各种误读。干扰IHC结果解读的因素包括：肿瘤细胞的胞浆染色、内对照细胞染色弱、肿瘤细胞的异质性、特殊的病理形态表现（如：淋巴细胞浸润肿瘤上皮，印戒细胞癌）、新辅助放化疗等。注意避免IHC结果解读的各种陷阱，对于准确识别LS至关重要，有助于节省患者和亲属的监测费用，并避免不必要的焦虑。同时，由于采用IHC进行LS的普查本身还存在一些固有缺陷，所以不能将IHC作为LS的唯一筛查手段，应综合应用各种筛查标准、IHC、MSI、BRAF V600E突变、MLH1启动子甲基化和基因的胚系突变检测，以便对LS做出准确的诊断。
内容节选
十一、MMR蛋白IHC结果解读的常见错误
理想情况下，MMR蛋白在大多数结直肠癌细胞的细胞核（>50%）中染色，而且染色强度相当于甚至高于自身内对照细胞。但是，由于肿瘤的异质性、组织固定、染色技术、抗体质量和新辅助放化疗等因素的干扰，可能会出现异常的染色情况，导致结果误读。本文将针对这些误读的原因和解决办法逐一进行阐述（表4）。
1、误将胞浆染色判读为’表达正常’（表4）
错配修复蛋白在增殖细胞的细胞核中表达，包括癌细胞、正常的肠黏膜上皮细胞和淋巴细胞。因此，只应评估核染色，胞浆染色可能反映了强背景染色，并且可能非常强，以至于会模糊细胞核，此时不应给予判读，建议重新染色。如果重新染色后仍然存在很强的胞浆染色，建议进一步检查（如MSI）。
2、肿瘤细胞核染色强度比自身对照弱，将肿瘤误判为’表达正常’（表4）：
有时，MMR蛋白在肿瘤细胞核中的染色强度与淋巴细胞或肠黏膜上皮细胞等正常内对照细胞核的染色强度不同。肿瘤细胞核染色与内部对照相似或更强的病例很容易被解释为表达正常。肿瘤细胞核的弱染色或不染色，伴随自身对照的弱染色或不染色；这种情况不应进行判读，建议重新染色。如果重复行IHC后对照仍为阴性，则应考虑行MSI检测。值得注意的是，一些dMMR的结直肠癌并不是完全没有肿瘤细胞核染色。肿瘤细胞核的弱或可疑染色伴随着内对照细胞的强染色也可能是dMMR。这种情况建议重新染色，如果结果相似，则建议进一步检查。
3、将异质性的染色归因于IHC染色的失败：
肿瘤的异质性染色可能是由于技术问题，这种情况往往伴随内对照细胞的不染色。然而，有些病例显示肿瘤染色缺失区域与肿瘤染色正常区域交替，同时内对照的染色正常。在某些情况下，具有不同染色模式的肿瘤区域显示出独特的形态变化；而在另一些情况下，在形态相似的区域中出现不同的染色模式。这种异质性可以反映肿瘤内亚克隆之间的分子变异。这些癌症一般不存在dMMR，也没有基因的胚系突变。在一些情况下，由于抗体扩散到组织中的不均匀性，导致组织外围的染色比组织内部的肿瘤细胞核更深。虽然活检标本的染色模式通常与手术切除标本有着良好的相关性，但肿瘤异质性可能是小活检标本的潜在问题。
4、将直肠癌放化疗后的染色弱或核仁染色误判为’染色缺失’（表4）：
新辅助放化疗后的直肠癌可能几乎完全丧失MSH6染色或仅有核仁染色；新辅助放化疗后，约30%的直肠癌出现PMS2染色减弱。这些病例大多没有基因的胚系突变。如果染色模棱两可，取放化疗前的活检标本进行IHC染色通常可以解决这个问题。
5、夸大LS的可能性：
过去认为，所有与MLH1启动子甲基化无关的dMMR都是由LS引起的，即使没有检测到MMR基因的胚系突变。患者和亲属均被建议终身随访监测。现在很清楚，这种情况叫林奇样综合征，是由多种原因引起，其中大多数与胚系突变和LS无关，需引起重视。
6、误以为IHC结果为pMMR即可排除LS：
MMR基因的一些胚系突变可能产生一些无功能的蛋白质，但是却保留其抗原性。在少数情况下，LS是由能够损害蛋白质功能的错义突变引起的，但这种错义突变却未能引起细胞内蛋白质的降解。这种错义突变的结果就蛋白质功能丧失，但是却保留了完整的与抗体结合的抗原表位（表2）。这种LS患者具有dMMR的机制和表型，并且发生各种癌症的风险升高，但其肿瘤的IHC检测结果为pMMR。因此，对临床疑似的LS患者，即使IHC检测结果为pMMR，也应进行MSI或者基因的胚系突变检测。
7、将不寻常的模式归因于免疫组化染色的失败（表2）：
如果4种MMR蛋白都为肿瘤细胞染色缺失，则应观察内对照细胞有无染色，如果内对照细胞也无染色，可能为组织固定或IHC技术问题导致的染色失败。如果内对照染色正常，而肿瘤细胞所有4种MMR蛋白均染色缺失，这种模式归因于MSH2的胚系突变（导致MSH2和MSH6表达缺失）和MLH1的甲基化（导致MLH1和PMS2表达缺失）。另一种不寻常的模式是MLH1和PMS2染色与MSH6染色的完全缺失或者异质性缺失。MSH6染色的克隆丢失可以通过位于MSH6编码区中的单核苷酸重复的二级突变来解释。由于MLH1缺陷导致的MSI在MSH6中引起继发性突变，使其从表达中沉默。如果内对照细胞染色完整，那么这些染色缺失就不应被视为IHC的技术失败。
8、误以为腺瘤与腺癌样本在筛查LS方面完全等同（表3）：
LS的IHC筛查首选腺癌组织，但有时也会选择腺瘤。除了MMR极其罕见的双等位基因胚系突变（组成性错配修复缺陷）之外，LS绝大多数情况下是由于杂合的胚系突变引起的。因此，LS中的腺瘤可能还没有获得导致MMR表达缺失的第二突变。研究发现LS患者中，66%的腺瘤显示dMMR，在大腺瘤（>5 mm）中百分比更高（88%）。伴有高度不典型增生、绒毛状组织或大于10 mm的腺瘤更可能发生第二次突变，导致dMMR。因此，LS患者的腺瘤可能为pMMR；当腺瘤组织检测结果为pMMR时，并不能排除LS。
9、使用无蒂锯齿状腺瘤来筛查LS或帮助锯齿状息肉的分型：
不应使用无蒂锯齿状腺瘤来筛查LS。腺瘤是LS的癌前病变，而锯齿状腺瘤（或锯齿状息肉）不是LS的癌前病变。一些锯齿状腺瘤通过散发性BRAF突变和MLH1甲基化而沿着锯齿状途径演变为微卫星不稳定癌。然而，除非等到锯齿状腺瘤变得发育不良，否则锯齿状腺瘤一般不会出现dMMR。检测MMR蛋白表达也不能用于锯齿状腺瘤的分类。
10、即使重复染色后，肿瘤和内对照均无染色，也不考虑组成性的错配修复缺陷（constitutional mismatch repair deficiency，CMMRD）：
染色或组织固定的技术问题，是肿瘤细胞和内对照细胞均出现染色缺失的最可能的原因。然而，由于MMR的双等位基因胚系突变，这也可以在CMMRD中看到。在这种情况下，外部阳性对照仍会染色，并可能提示组织存在问题或CMMRD。因此，如果内对照细胞在重复IHC后未能染色，则应推荐对其他组织进行检测和/或进行基因突变检测。这种罕见的CMMRD应包括在这些案例的鉴别诊断中。
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